摘要：铁死亡·是一种伴随铁依赖的脂质过氧化反应的细胞死亡，因此刺激性铁死亡可能是治疗胃癌的一种潜在策略。济源冬凌草甲素(JDA)是从济源冬凌草中分离得到的一种天然化合物，具有抗肿瘤活性，抗肿瘤机制尚不清楚，水溶性有限，阻碍了其临床应用。而JDA衍生物a2可以抑制胃癌细胞的生长。随后，首次发现了甲氧苄啶诱导的铁死亡。重要的是，化合物A2降低了Gpx4的表达，过表达的Gpx4拮抗了FA2的抗增殖活性。此外，还证实了a2通过自噬途径引起亚铁积累，从而阻止了a2诱导的亚铁升高和细胞生长抑制。此外，a2在胃癌细胞系来源的异种移植小鼠模型中表现出比5-氟尿嘧啶更有效的抗癌活性。来自不同患者的患者来源的肿瘤异种移植模型对a2表现出不同的敏感性，GPX4下调表明肿瘤对a2的敏感性。最后，a2表现出良好的药代动力学特征。总的来说，数据表明，诱导铁死亡是介导a2抗肿瘤活性的主要机制，a2有望成为治疗胃癌的有希望的化合物。
介绍：胃癌是第五大常见癌症，也是第三大癌症死因。草药冬凌草一直被单独或与其他中草药配伍用于治疗胃肠道疾病。济源冬凌草甲素(JDA)是本课题组首次分离鉴定的。龙须草二萜类化合物可通过调节细胞周期、细胞凋亡、自噬和转移而发挥抗肿瘤作用。在本研究中，发现一种JDA衍生物a2可以特异性地抑制胃癌细胞的生长，铁死亡的预防有力地挽救了被a2抑制的细胞生长，而诱导铁死亡是一种破坏癌细胞的新方法，从而使a2成为一种很有前途的胃癌治疗药物。
结果：
化合物A2选择性地抑制胃癌细胞的生长。
作者在检测a2对胃癌细胞的抑制作用中，通过测定人胃上皮细胞系GES1和6种胃癌细胞系MGC-、HGC-27、SGC-、MKN-45、AGS和BGC-的GI50值，发现a2选择性地抑制胃癌细胞的生长，同时高浓度a2可导致细胞死亡。此外a2能显著增加G2/M期细胞数，减少S期细胞数。因此，A2对胃癌细胞表现出明显的抗增殖活性，并将其阻滞在G2/M期。
图一化合物A2选择性地抑制胃癌细胞的生长。
化合物A2诱导胃癌细胞线粒体依赖性凋亡
考虑到a2在高浓度时引起细胞死亡，以及不同的内酯类二萜类化合物诱导细胞凋亡，作者检测了a2是否能诱导细胞凋亡，发现a2诱导了细胞凋亡。线粒体膜电位通过JC-1染色检测，其缺失标志着线粒体依赖性凋亡的启动。化合物a2显著诱导线粒体电位丧失，表明a2引起线粒体损伤。S2G、A2呈剂量依赖性地降低抗凋亡蛋白bcl-2水平，上调裂解半胱氨酸蛋白酶9/3和PARP蛋白水平，证实a2诱导胃癌细胞线粒体依赖性凋亡。在探索细胞凋亡对a2抗肿瘤活性的贡献时，发现a2抑制细胞生长而与细胞凋亡无关。因此，a2可诱导MGC-和MKN-45细胞凋亡，而a2抑制MGC-细胞生长部分依赖于凋亡。
图二化合物A2诱导胃癌细胞线粒体依赖性凋亡
化合物a2诱导胃癌细胞铁死亡
为了进一步探讨a2抗癌作用的机制，作者从对照和处理的MGC-细胞中提取mRNAs，发现化合物a2以一种看似矛盾的方式影响编码铁死亡相关蛋白的mRNA：编码关键抗铁死亡激酶Gpx4的mRNA减少，而a2上调编码抗铁死亡蛋白SLC7A11的mRNA。用C11-BODIPY/测定脂质活性氧(ROS)，以探讨A2是否引起铁死亡，发现化合物a2剂量依赖性地增加MGC-和MKN-45细胞中脂质ROS的产生，证实a2诱导细胞铁死亡。此外，还测量了总活性氧(TROS)，其升高将引发铁死亡。根据ROS的变化，发现ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以极大地挽救由a2阻止的细胞生长。此外，与对照细胞相比，a2处理的细胞中的线粒体变小并且膜密度增加。因此，a2可诱导胃癌细胞铁死亡。
图三化合物a2诱导胃癌细胞铁死亡
化合物A2通过降低Gpx4诱导铁死亡
SLC7A11和Gpx4是两种重要的蛋白质，它们分别通过引入L-胱氨酸和催化脂质过氧化物的减少来负向调节铁死亡。然而，A2诱导了MGC-细胞中SLC7A11和Gpx4的相反变化。作者在研究GPX4在a2诱导的细胞停滞中的生物学功能中，发现GPX4在胃癌细胞中过表达。GPX4过表达显着逆转了MGC-和MKN-45细胞中a2抑制的细胞生长，Gpx4抑制剂RSL3和A2在低浓度下对MGC-细胞具有相加的抗增殖活性，表明RSL3和a2均通过抑制Gpx4发挥抗癌活性。此外，高表达Gpx4的细胞系对a2更为敏感，升高的SLC7A11拮抗了a2诱导的细胞生长抑制，SLC7A11的降低增强了细胞对a2的反应，同时SLC7A11蛋白水平与a2的GI50值之间没有观察到的关系。综上所述，这些数据表明a2通过降低Gpx4的表达来抑制细胞生长，而升高的SLC7a11则拮抗a2的抗增殖活性。
图四化合物A2通过降低Gpx4诱导铁死亡
化合物a2通过亚铁(Fe2t)积聚诱导细胞铁死亡
鉴于铁死亡是一种由铁依赖的脂质过氧化引起的调节细胞死亡的形式，作者在a2存在的情况下测试了亚铁的含量，发现a2显著增加了MGC和MKN-45细胞中铁的积累，同时铁螯合剂去铁胺能显著逆转a2抑制胃癌细胞生长的作用。考虑到自噬可以通过降解铁储存蛋白铁蛋白而导致细胞外铁过量，作者利用自噬抑制剂3-MA来探讨自噬在a2诱导的亚铁积累中的作用，发现在MGC-和MKN-45细胞中，由a2引发的亚铁积累可以被3-MA完全阻止，这表明a2通过自噬诱导了过量的亚铁积累。同时a2可剂量依赖性地诱导LC3B的表达。A2和3-MA联合作用的相对抑制率明显低于a2单独作用。总之，a2通过自噬依赖性亚铁积累诱导细胞生长抑制。
图五化合物a2通过亚铁(Fe2t)积聚诱导细胞铁死亡
化合物a2对cdx和pdx胃癌模型的肿瘤生长均有抑制作用，而gpx4的下调表明pdx模型对a2的敏感性。
作者在测定a2在mgc-cdx小鼠模型中的抗肿瘤作用中，发现a2对肿瘤生长的抑制作用呈剂量和时间依赖性，a2在10mg/kg和20mg/kg时的抗肿瘤作用强于阳性对照药物5-FU。此外，与5-FU相比，a2对小鼠体重的影响较小，同时a2在CDX小鼠胃癌模型中表现出较强的抗肿瘤作用，且副作用较小。接下来，作者在胃癌PDX模型中检测a2的抗肿瘤活性，发现PDX模型中的肿瘤对a2表现出不同的敏感性。在治疗结束时进一步检测了Gpx4的表达，发现在敏感的PDX模型包括PDX-01、PDX-02和PDX-03中，a2降低了Gpx4的表达，而在耐药的PDX模型中，Gpx4表现出对a2的抗性，即a2通过下调Gpx4诱导铁死亡。而在PDX模型中，5-FU的抗肿瘤活性与Gpx4的表达无关。因此，这些结果表明，在PDX模型中，a2对肿瘤生长有不同程度的抑制作用，Gpx4的下调可以作为a2对肿瘤敏感性的生物标志物。
图六化合物a2对cdx和pdx胃癌模型的肿瘤生长均有抑制作用，而gpx4的下调表明pdx模型对a2的敏感性。
化合物a2具有良好的药代动力学特性。
A2优异的抗肿瘤活性促使我们评估其药代动力学参数。采用caco-2细胞通透性试验测定人肠道对a2的吸收。测试的a2的Papp(A-B)值为16.08，表明a2是对Caco-2单层从A到B的中等渗透性化合物。A2的Papp(B-A)/Papp(A-B)值为0.2，表明a2不会发生主动外排。作者通过使用人、大鼠、小鼠、狗和猴的肝微粒体来测定a2的体外固有清除，发现ClhumanCldogClratClmouseClmonkey.。与维拉帕米相比，a2在不同物种中表现出无差别的代谢效应。因此，a2表现出较强的微粒体代谢稳定性和较小的物种多样性。进一步评价了a2在雄性SD大鼠体内的药代动力学参数。发现a2的Cmax为18,ng/mL。半衰期为3.93h，平均停留时间为1.54h。因此，这些数据表明a2具有更好的药代动力学特性。
图七化合物a2具有良好的药代动力学特性。
总结：综上所述，作者发现了一种新的JDA衍生物a2，它在胃癌细胞和小鼠模型中都表现出极好的抗肿瘤效果和轻微的不良反应。化合物A2选择性抑制胃癌PDX模型中Gpx4表达的肿瘤生长。众所周知，胃癌是一种高度异质性的肿瘤，具有多种分子特征。因此，Gpx4的下调可以作为指示a2在胃癌中的抗肿瘤活性的生物标志物。
Thankyou！
扫码
本文编辑：佚名
转载请注明出地址 http://www.donglingcaoa.com/dlccd/8990.html
